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TechOzyme - octobre 2017

Le tri cellulaire magnétique
Sélection de cellules immunitaires d’intérêt parmi un mélange hétérogène de populations

Tri cellulaire magnétique - Sélection cellulaire magnétique

Pour les études immunologiques, le tri cellulaire est utilisé pour isoler in vitro des populations cellulaires pures. Les cellules triées doivent être vivantes et fonctionnelles pour pouvoir étudier leurs fonctions ou même les réinjecter in vivo à des animaux de laboratoire.


Différentes méthodes existent pour trier des cellules d’intérêt en immunologie :

  • - La méthode physique basée sur la centrifugation sur Ficoll
  • - Les méthodes immunologiques, par cytométrie avec un trieur (FACS) ou encore à l’aide de billes magnétiques

  • Les paramètres permettant d’évaluer la qualité du tri sont la pureté, le rendement et la viabilité des cellules triées.

La séparation cellulaire magnétique reste la technique de choix car elle combine de nombreux avantages comparativement aux autres techniques de séparation. Elle permet d’isoler simplement des cellules issues directement d’échantillons non traités comme le sang ou la moelle osseuse. De plus, comme le tri par cytométrie en flux (trieur FACS), elle est spécifique car elle repose sur l’utilisation d’anticorps pour sélectionner la population cible. Par contre, à la différence du tri par FACS, la sélection d’une population de cellules viables par tri cellulaire magnétique est très rapide.

Dans ce TechOzyme sont présentés le principe et les avantages de 2 technologies basées sur l’utilisation de billes magnétiques. Dans une première partie, nous aborderons la technologie MojoSort™ qui permet de faire une sélection positive ou négative des cellules d’intérêt à partir de populations hétérogènes. Dans une seconde partie, nous décrirons la technologie des Streptamers® qui repose sur un tri positif et réversible des cellules.

Sommaire

La technologie MojoSort™

Les kits MojoSort™ sont des systèmes de tri cellulaire magnétique qui permettent de séparer et purifier efficacement une population cellulaire définie parmi un mélange hétérogène de populations, grâce à l’utilisation de nanoparticules magnétiques. Les cellules peuvent être isolées par sélection positive ou négative.

Comment ça fonctionne ?

Dans la sélection positive, les cellules d’intérêt sont incubées et donc marquées avec les nanobilles MojoSort™, des particules magnétiques directement conjuguées à des anticorps spécifiques des cellules à sélectionner.

Dans la sélection négative, la population d’intérêt n’est pas ciblée et reste intacte tandis que toutes les autres cellules sont marquées. Dans ce cas, on utilise les MojoSort™ Isolation Kits incluant un cocktail d’anticorps spécifiques des autres types cellulaires et conjugués à la biotine et des nanobilles magnétiques streptavidine.

Après séparation avec un aimant, les deux fractions de cellules (d’une part, les cellules d’intérêt et d’autre part les autres cellules) peuvent être utilisées pour des applications ultérieures comme des tests fonctionnels, de la caractérisation phénotypique, ...

Schéma du principe de la technologie MojoSort™

Avantages

Le tri des cellules grâce à la technologie MojoSort™ est très rapide et facile. Il s’agit d’une simple séparation magnétique après une étape d’incubation. En raison des propriétés des nanobilles magnétiques, le système est également compatible avec la séparation sur colonnes. Cependant, certains ajustements de protocole sont nécessaires notamment la dilution des nanobilles.
La méthode est flexible car les cellules peuvent être triées négativement ou positivement. Dans le cadre de la sélection négative, on peut aussi parler d’enrichissement. On peut également utiliser ce système de tri sous une hotte.

Les cellules isolées par la technologie MojoSort™ conservent leur fonctionnalité et peuvent donc être utilisées ensuite pour des tests fonctionnels, de l’expression de gènes et de la caractérisation phénotypique. Par exemple, notre partenaire BioLegend a testé la fonctionnalité de cellules de souris CD4 positives isolées à partir de la rate avec des nanobilles directement conjuguées avec un anticorps anti-CD4. Il a été mis en évidence que la migration et la différenciation de ces cellules n’étaient pas affectées.

La purification est très performante en termes de rendement et de pureté des cellules. Les diagrammes suivants montrent le niveau élevé de pureté obtenu pour des cellules T CD4+ isolées à partir d’une suspension cellulaire de ganglions lymphatiques et de rate de souris C57BL/6 en utilisant le MojoSort™ Mouse CD4 T Cell Isolation Kit . Les cellules sont marquées avec un anticorps PE anti-mouse CD4 (clone RM4-4), un anticorps APC anti-mouse CD3ε (145-2C11), et le 7-AAD pour exclure les cellules mortes de l’analyse.

tri cellulaire magnétique MojoSort pureté

La technologie des Streptamers®

Dans les méthodes conventionnelles de sélection cellulaire magnétique, on utilise des anticorps couplés à des billes. Ceux-ci restent complexés aux cellules purifiées, ce qui peut modifier les propriétés intrinsèques des cellules étudiées. A la différence de ces méthodes traditionnelles, la technologie Streptamer®, inventée par Dirk H. Bush en 2002, repose sur l’isolement magnétique de cellules à l’aide d’agents totalement réversibles, les Streptamers®. Ces agents ont l’avantage d’avoir d’excellentes intensités de marquage et surtout de pouvoir être éliminés des cellules conservant ainsi leurs fonctions biologiques.

 

Les Streptamers® : qu’est-ce que c’est ?
Les Streptamers® sont des multimères issus de l’oligomérisation de plusieurs molécules MHC I (MHC I Streptamers®) ou fragments Fab (Fab Streptamers®) couplés à un Strep-tag® sur de la Strep-Tactin®, elle-même conjuguée à des billes magnétiques. Les Strep-tag® sont de petits peptides ayant une haute affinité pour la Strep-Tactin®, un dérivé de la Streptavidine.

 

Comment sont sélectionnées les cellules ?
Les Streptamers® se lient ensuite aux cellules d’intérêt via l’intéraction du complexe CMH-antigène-TCR (MHC I Streptamers®) ou du Fab-marqueur de surface (Fab Streptamers®). Les MHC I Streptamers® présentent un antigène (peptide viral) spécifique des cellules T CD8+ que l’on cherche à isoler.
Après séparation des cellules marquées des cellules non-marquées à l’aide d’un aimant, de faibles concentrations de biotine sont ajoutées. La biotine entre en compétition avec la liaison des Strep-tag® à la Strep-Tactin®, entrainant la dissociation de cette dernière. Spontanément, les Strep-tags® se détachent ensuite des cellules.

Représentation schématique de la sélection avec des Streptamers®
principe de la technologie Streptamer

Les populations lymphocytaires que l’on peut trier par cette technologie sont les lymphocytes T CD8+ spécifiques d’antigènes et les grandes populations lymphocytaires CD4+, CD8+,… comme décrit par la suite.

 

Avantages de la technologie des Streptamers®
La technologie des Streptamers® est réversible. En effet, après la sélection, on observe la dissociation complète des réactifs de marquage (Streptamers®) des cellules. Les cellules sélectionnées sont au final dépourvues des réactifs de marquage ayant servi à leur purification. Les cellules isolées restent viables, ne sont pas stimulées et conservent leurs fonctions biologiques. Elles peuvent être utilisées pour des applications de recherche ou de diagnostic. A titre d’exemple, les Streptamers® préservent l’expression des récepteurs sur les cellules T CD8+ comme démontré dans l’article de Zhang et al. , 2016.

La purification à l’aide de Streptamers® est aussi très performante en termes de pureté et rendement des cellules isolées, comme décrit dans l’article de Keldermann, et al. , 2016.

Ce système de purification basé sur l’utilisation des Streptamers® est également modulable avec une manipulation minimale des cellules. Les cellules peuvent en effet être purifiées comme vu plus haut via une purification magnétique avec la Strep-Tactin® couplée à des nanobilles, mais aussi de manière fluorescente par le biais de Strep-Tactin® couplée à un marqueur fluorescent (PE/APC). Dans ce 2ème cas, la purification se fait par cytométrie en flux.

Des populations rares peuvent être sélectionnées positivement grâce aux Streptamers® en utilisant une combinaison de différents marqueurs. A titre d’exemple, on peut sélectionner de manière séquentielle les Treg avec des Fab Streptamers® (CD4+CD25+CD45RA).

Il existe d’autres multimères, comme des tétramères. Il a cependant été décrit que leur utilisation modifiait significativement le phénotype et les fonctions des cellules isolées (Knabel et al., 2002). Les capacités prolifératives des cellules peuvent aussi être altérées par l’utilisation de ces tétramères conventionnels.
Il existe également des pentamères, mais leur efficacité de purification est moindre comparativement aux Streptamers® comme décrit dans l’article de Ciáurriz et al., 2016.

 

- Les Fab Streptamers®

Les Fab Streptamers® sont destinés à la sélection positive et réversible à partir de PBMCs, des lymphocytes T (CD3, CD4, CD8), des T mémoires (CD8, CD62L, CD45RA-), des T régulateurs (CD4, CD25, CD45RA), des cellules T naïves (CD8, CD62L, CD45RA) et des cellules B (CD19). Les Fab Streptamers® reconnaissent les marqueurs de surface propres à chaque type de cellule immunitaire citée ci-dessus.

En savoir plus sur les Fab Streptamers® 

Liste des kits Fab Streptamers® 


- Les MHC I Streptamers®

Les MHC I Streptamers® permettent de sélectionner de manière positive et réversible des cellules T CD8+ spécifiques d’un antigène à partir de PBMCs. L’antigène présenté par le Streptamer® est alors un peptide viral (nombreux peptides différents : différentes combinaison épitopes-allèles).

En savoir plus sur les MHC I Streptamers® 

 

Liste des kits MHC I Streptamers®

Questions fréquemment posées

  1. Peut-on refaire un tri positif sur des cellules déjà triées par cytométrie en flux avec un trieur ?
    Oui, c’est possible. Mais, si l’on cible le même marqueur que celui utilisé pour le tri, il est recommandé d’utiliser un anticorps de clone différent ciblant un ou des épitopes différents du 1er anticorps utilisé pour le tri par cytométrie.

    La technologie MojoSort™ est-elle compatible avec d’autres systèmes de séparation magnétique ?
    Oui, il est possible d’utiliser des aimants d’un autre fournisseur ou encore des colonnes. Cependant, le protocole devra être optimisé pour garantir des résultats optimaux en termes de rendement et de pureté.

    Faut-il travailler à une température particulière avec les Streptamers® ?
    Il est recommandé de conserver les cellules à une température proche de 4°C tout au long de l’expérience, ce qui assure une sélection de cellules parfaitement fonctionnelles et non induites.


Le saviez-vous ?

  1. Connaissez-vous la taille des particules magnétiques utilisées dans la technologie MojoSort™ ?
    Le diamètre moyen des particules magnétiques MojoSort™ est de 130 nm.

    Quelle est la taille d’un Strep-tag® ?
    Un Strep-tag® se compose de 8 acides aminés pour un poids moléculaire de 1 kDa.

    Quelle est l’affinité de liaison d’un Strep-tag® pour la Strep-Tactin® ?
    Le KD est de 1 μM. Le Strep-tag® présente 100 fois plus d’affinité pour la Strep-Tactin® que pour la streptavidine.
     

 

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